Die gesetzliche und gesellschaftliche Diskriminierung der Juden führt ab 1933 zu tiefgreifenden Veränderungen in der Arbeit des Heims. Durch den Ausschluss jüdischer Mädchen aus allgemeinen Fachschulen wird »Isenburg« verstärkt zur Ausbildungsstätte für hauswirtschaftliche und soziale Berufe. Die Zahl der Kinder und Jugendlichen mit sonder- und heilpädagogischem Betreuungsbedarf wächst, da diese in öffentlichen Einrichtungen keine Aufnahme mehr finden. 1935/36 werden sieben Heimbewohnerinnen zwangsweise sterilisiert. Ab 1937 dürfen die Heimkinder die Neu-Isenburger Volksschule nicht mehr besuchen.

Bertha Pappenheim ist tief in der deutschen humanistischen Tradition verwurzelt. Sie vertraut unerschütterlich auf die Errungenschaften der jüdischen Emanzipation und ist eine Gegnerin des Zionismus. Erst ab 1935 nimmt sie Praktikantinnen auf, die sich auf die Emigration nach Palästina vorbereiten.

»Für einen kleinen Teil der Judenschaft mag Palästina räumlich schon etwas bedeuten – für den Geist des Judentums ist die Welt gerade groß genug.« (BERTHA PAPPENHEIM AM TAG DER VERKÜNDUNG DER NÜRNBERGER GESETZE, 15.9.1935)

Am 28. Mai 1936 stirbt Bertha Pappenheim nach längerer Krankheit im Alter von 77 Jahren. Ihre seit 1922 leitend im Heim tätige Schülerin Helene Krämer führt die Einrichtung bis zu ihrer Emigration 1941 weiter.

Während des Novemberpogroms 1938 brennen nationalsozialistische Gewalttäter Haus I nieder und beschädigen Haus II. Das Heimvermögen wird beschlagnahmt. Entrechtet und ausgegrenzt leben die Frauen und Mädchen in materieller Not und in Angst vor Übergriffen. Die Behörden weisen nun willkürlich Kinder und Jugendliche ein; durch Auswanderung wechseln die Betreuerinnen häufig.

»Niemand darf still bleiben, der weiß, dass irgendwo ein Unrecht geschieht. Von Unrecht wissen und schweigen, macht mitschuldig.« (BERTHA PAPPENHEIM, 1924)

Am 31. März 1942 wird das Heim zwangsweise aufgelöst. Die Bewohnerinnen werden in Ghettos und Vernichtungslager verschleppt und dort grausam ermordet. Die letzte Heimleiterin, Sophie Sondhelm, wird im Februar 1943 von Darmstadt aus in das Ghetto Theresienstadt deportiert. Von dort führt ihr Leidensweg im Oktober 1944 nach Auschwitz.